免疫组化实验是一项精密的技术操作，需要严格把控各个环节以确保结果的准确性和可靠性。以下是免疫组化实验的关键注意事项：
一、血清封闭
血清封闭的目的是为了一抗与组织的非特异性结合，造成假阳性，一般会采用BSA、羊血清等封闭这些位点，封闭血清一般是和二抗同一来源的，室温封闭10-30min。
二、一抗和二抗浓度和孵育时间
不同的一抗浓度，孵育时间和温度等对染色结果往往有较大的影响。在4℃下，反应缓慢，背景较浅；而37℃反应较快，时间较短；室温介于两者之间，二抗一般室温孵育30min。
三、DAB显色
检测背景的深浅和特异性染色的深浅基本上都以DAB孵育条件决定。DAB的显色时间并不是固定的，主要方法是使用显微镜控制显色时间，到出现特异性染色较强且出现背景着色较浅时就可以冲洗。如果DAB显色时间过长（超过十分钟）才出现阳性染色，可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长，也可以加入金属离子来增强显色（如硫酸铜、氯化钴、硫酸镍铵等）；如果DAB显色时间过短颜色就很深，这可能是一抗过高，需要下调抗体浓度，如果短时间内过深
四、复染
免疫组化染色后为了衬托出组织形态结构有必要进行复染，常用试剂为Mayer’s苏木染色，一般为2 min左右，DAB在核蛋白着色的时间可以适当缩短，*后用氨水或PH 8.0的TBS返蓝。
五、封片
在封片阶段我们通常是用中性树胶来进行，封片过程中注意斜靠盖玻片防止气泡的产生从而对结果进行营影响，建议*好在通风橱操作，这样有利于气泡排除干净，不影响后续的镜检。
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