阅读次数：876 发布时间：2015/8/21 15:04:10
中性粒细胞碱性磷酸酶活性检测步骤说明
１ 原理
中性粒细胞中的碱性磷酸酶（简称碱酶）在一定条件下能使β－甘油磷酸钠水解释出无机磷，后者与钼酸试剂结合成磷钼酸复合物，再以氨基萘酚磺酸还原为钼蓝而呈现蓝色，用光电比色法求得所释放的无机磷含量，表示酶的活性。
２ 试剂
ａ．葡聚糖：分子量２０万，用生理盐水配制成２％溶液，在冰箱中可保存一个月。
ｂ．β－甘油磷酸钠溶液（０．０２６Ｍ）：称取β－甘油磷酸钠溶于碳酸—重碳酸盐缓冲溶液，将ｐＨ调至９．９，液面盖一层石油醚，在冰箱内保存。
ｃ．碳酸－重碳酸盐缓冲液：
Ａ液 称取无水碳酸钠２．１２ｇ，溶于重蒸馏水１００ｍｌ，配成０．２Ｍ无水碳酸钠溶液。
Ｂ液 称取碳酸氢钠１．６８ｇ，溶于重蒸馏水１００ｍｌ，配成０．２Ｍ碳酸氢钠溶液。
取Ａ液１００ｍｌ与Ｂ液１００ｍｌ混合，加重蒸馏水６００ｍｌ，ｐＨ为９．９。
ｄ．皂素：用生理盐水配成２％溶液。
ｅ．氯化镁溶液（０．０５Ｍ）：用重蒸馏水配成。
ｆ．三氯乙酸溶液：用重蒸馏水配成５０％及５％二种浓度。
ｇ．钼酸铵溶液：称取钼酸铵１２．５０ｇ，溶于重蒸馏水１００ｍｌ，加１０Ｍ硫酸１５０ｍｌ，再加重蒸馏水到５００ｍｌ。
ｈ．０．２５％氨基萘酚磺酸溶液：称取氨基萘酚磺酸０．０６２５ｇ、亚硫酸氢钠１．３３ｇ、亚硫酸钠０．２５ｇ，于研钵中磨成细粉，加重蒸馏水到２５ｍｌ，过滤后保存于冰箱内。用时稀释一倍。
ｉ．标准磷储备液（每毫升含无机磷１ｍｇ）： 称取干燥恒重的分析纯磷酸二氢钾２．１９７１ｇ置于容量瓶中，加重蒸馏水至５００ｍｌ，加氯仿２滴，在冰箱内保存。
ｊ．肝素：用生理盐水配成１％溶液。
３实验方法
３．１ 白细胞分离
自耳垂或手指取血０．１５ｍｌ，置于预先准备好的含１滴肝素和０．３０ｍｌ葡聚糖溶液的微量试管中，用手振摇混匀，静置１０分钟。待红细胞沉降界面清晰时，小心吸出上层悬浮液，置于小离心管中，加入２倍生理盐水，摇匀后离心（２５００转／分钟）８分钟。取出上清液弃去，保留沉淀。再向有沉淀的离心管加生理盐水２ｍｌ，混匀，再离心８分钟。重复２次，弃去上清液，管中留下液体约０．１５ｍｌ，与沉淀混匀，即为白细胞悬浮液，作白细胞计数２～４次，取其
平均值。 此白细胞悬浮液供酶活性测定之用。如不能立即测定，需放置冰箱内，
但必须在当天测定。
３．２ 白细胞碱酶活性的测定
取一小试管，加入β—甘油磷酸钠 ０．８５ｍｌ ，皂素 ０．０５ｍｌ，
氯化镁０．０２ｍｌ，于３７℃水浴中预热５分钟，然后准确加入白细胞悬浮液０．０５ｍｌ，混匀，继续保温６０分钟，到时立即加入５０％三氯乙酸０．１５
ｍｌ使反应终止，以２５００转／分离心１０分钟，除去沉淀。
每个样品都需作对照管测定，对照管所加内容物同上，仅白细胞悬浮液须在保温后加５０％三氯乙酸后加入。
分别取样品和对照管上清液０．８０ｍｌ，各加入钼酸铵试剂０．１５ｍｌ，氨基萘酚磺酸溶液０．１０ｍｌ，重蒸馏水１．４５ｍｌ，显色２０分钟，用分光光度计测定光密度（ 所用波长为６６０ｎｍ、比色杯厚１０ｍｍ ），分别读取样品管、对照管的光密度。每管重复读数两次，取其平均值。
３．３ 磷标准曲线的制定
取标准磷储备液，用５％三氯乙酸稀释成不同浓度的标准磷应用液，浓度分别为：１．０，３．０，５．０，７．５，１０．０ｍｇ／１。然后取试管５支，分别在每一试管加入１．０ｍｌ上述标准磷应用液之一种，以及钼酸铵０．１５
ｍｌ，氨基萘酚磺酸０．１０ｍｌ，重蒸馏水１．２５ｍｌ，按上法显色，读取
各管的光密度，绘制标准曲线图。
３．４ 白细胞分类计数
在取血分离白细胞的同时，取１滴血作涂片，瑞氏染色，按常规分类计数嗜中性白细胞的百分比。
３．５ 计算方法
白细胞碱酶活性用单位表示，以每十亿个中性白细胞在３７℃条件下，１小时释放出１ｍｇ无机磷为一个单位。计算公式如下：
酶活性（单位）＝｛〔ｐｉ（样）—ｐｉ（对）〕×１００００×１．４０｝÷（Ｗ·Ｖ·Ｎ）
式中：ｐｉ（样）——样品管无机磷，μｇ；
ｐｉ（对）——对照管无机磷，μｇ；
Ｗ——白细胞悬液的白细胞数，个／立方毫米；
Ｖ——酶反应所加入白细胞悬液的量，ｍｌ；
Ｎ——嗜中性白细胞，％。
注：为减少操作误差，提高结果准确性，也可自静脉采血１．５ｍｌ，按常量法进行操作。详见《卫生研究》５（６）：４８１，１９７６。
４ 注意事项
ａ．白细胞悬液必须充分摇匀，不应有聚集的细胞。白细胞计数要准确，一般应计数２～４次，取平均值。
ｂ．碱酶活性测定中，白细胞悬液的加入量要准确，吸取时注意摇匀。
ｃ．碱酶反应保温时间（６０分钟）要准确。
ｄ．显色反应不应出现沉淀。
ｅ．用分光光度计读数时，样品管与对照管都应重复两次。
原创作者：上海恒远生物科技有限公司
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