恒远解析蛋白质（免疫）印迹
A. 样品准备
样品准备适用于单层细胞，细胞悬液和组织样品。
单层细胞
•细胞在 100 mm x 20 mm 有盖培养皿中生长至将近铺满。移去细胞培养液，用室温的 1x PBS （10X liquid PBS: sc-24946）冲洗。以下步骤应在冰上或 4° C 下进行，用新鲜的冰置缓冲液。
•单层细胞培养瓶中加 0.6 ml RIPA 缓冲液（sc-24948）。4° C 下轻轻摇动 15 分钟。用刮棒将粘附的细胞刮起。裂解液移至微离心管。
•用 0.3 ml RIPA 缓冲液冲洗培养瓶并倒入前述细胞裂解液。（也可加 10 µl 10 mg／ml PMSF (产品编号 sc-3597)储存液和／或通过21号针头以打断DNA）置于冰上裂解 30 分钟。
•细胞裂解液4℃，10,000xg， 离心 10 分钟。上清液为全细胞裂解液。将上清移至另一新微离心管，即提取的全细胞裂解液。如果想增加蛋白的提取量，可用少量的 RIPA 缓冲液重悬沉淀。离心后上清液，与之前上清液混合。
悬浮细胞
•室温下通过低速离心（200xg）5 分钟，收集大约 2.0x107 细胞。小心移去培养基。
•室温下用 PBS 洗涤细胞沉淀，然后再次用低速离心收集细胞。小心移去上清。
•加 1.0 ml 冰冷 RIPA 缓冲液（sc-24948）。RIPA 缓冲液使用前新加入（蛋白酶抑制剂）和/或（磷酸酶抑制剂）。用移液管轻轻重新悬浮细胞，置于冰上裂解 30 分钟。
•进一步用水压破碎法（21 号针）、匀浆器或超声制备细胞均浆。切记勿使裂解液温度升高（可加入 10 mg/ml PMSF 储存液 10 µl : sc-3597）冰浴 30 分钟。
•将细胞匀浆移至微离心管，10,000g，4℃，离心 10 分钟。上清液即全细胞裂解液，将上清液移至一个新的微离心管。这就是您的全细胞裂解液。如果想增加蛋白的提取量，可用少量的RIPA缓冲液重悬沉淀,离心后取上清液，与前面上清液混合。
组织样品
•给组织称重并用干净的刀片将其切成很小的块。冰冻组织应切成非常薄的薄片，并在含有（蛋白酶抑制剂 ）和/或(磷酸酶抑制剂）的 RIPA 缓冲液（sc-24948）中解 冻。每克组织约使用3 ml冰RIPA缓冲液。
•进一步用匀浆器或超声制备细胞匀浆。所有操作保持在 4°C。（每克组织可加入 10mg／ml PMSF 储存液 30 µl : (sc-3597)）置于冰上 30 分钟。
•移至微离心管 10,000xg，4° C 下离心 10 分钟。上清移至新的离心管中再离心。上清液即全细胞裂解液。必要时延长离心时间以获得澄清的裂解液。
B. 电泳
•样品（每道上样量：40－60 µg 全细胞裂解液，10－20 µg 去胞核或 10－20 ng 纯化蛋白）与同体积的 2 倍浓度的电泳上样缓冲液（sc-24945）混合并煮沸 2－3 分钟。多余的样品可储存在 －20° C。
•每道宽 1.0 mm，厚 0.7 mm 的胶最大上样量为 10 µl。
•我们建议你使用 Cruz Marker™ 标准分子量（ sc-2035）。 0.75 mm的胶每孔上样 2 μl，1.5 mm的胶每孔上样 5 μl。如果用与二抗匹配的Cruz Marker™ ，加入检测试剂后，将出现标准条带。另外也可以使用预染的标准分子量 (sc-2361)。
•根据标准流程进行电泳。
•用 electroblotting apparatus 将蛋白转移到硝酸纤维膜或 PVDF 膜上。操作方法参照厂家说明书进行。
C. 免疫染色
•把膜放在封闭液封闭非特异性片段（Blotto A 或者 Blotto B; 如果用抗牛的二抗，建议用无IgG的 BSA, sc- 2323），室温下孵育 30-60 分钟。 (UltraCruz™ 孵化盘 提供多种颜色的200ml或120ml)也可以把膜放在4℃，使用不带Tween-20的Blotto，过夜封闭。
•如果是磷酸化特异性抗体，封闭液和抗体稀释液中需分别加 0.01% (v/v) 磷酸酶抑制剂混合物 A 和 B (sc-45044 and sc-45045)。
•将封闭好的膜置于用 Blotto 稀释的一抗中室温下孵育 1 小时。（磷酸化特异性抗体: Blotto B 中加入 0.01% (v/v) 磷酸酶抑制剂Cocktails A 和 B (sc-45044 和 sc-45045）。事先应做一个抗体滴度以便找出最佳的抗体浓度。我们建议的起始稀释浓度是 0.5-2.0 µg/ml。用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 分钟。
•将膜置于用 Blotto 1:500-1:2000 稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗或碱性磷酸酶标记的二抗（常规免疫印迹二抗）中室温孵育 45 分钟。如果出现背景偏黑，二抗应该进一步稀释（可达1：20,000）。如果电泳时用了 Cruz Marker™ 标准分子量（sc-2035），必需用Cruz Marker™ 匹配的二抗，以便能用 ECL 显示标准分子量。
•TBST 洗膜 3 次，每次 5 分钟，TBS（缓冲液和常规液体）。
•将膜与化学发光试剂发光氨（sc-2048）一起孵育，请参考发光氨说明书。或用蛋白显色的标准试验方法。如果用发光氨显示，必需用辣根过氧化物酶标记的二抗。、
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