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WB实验中蛋白样品的定量方法如何选择?

阅读次数:1030    发布时间:2019/5/30 10:08:18

  WB实验技术交流第一期内我们通过裂解细胞,组织等步骤已经把蛋白提取出来,但提出来后要怎么知道提出的效果怎么样,怎么才能在同等量上上样。这就需要进行蛋白定量,目前用得最多的定量方法有两种,一种是BCA法,一种是Bradford 法。今天恒远小编下面我们详细介绍下这两种定量方法的原理与优缺点:

  BCA法:

  BCA蛋白定量法是目前广泛使用的蛋白定量方法之一。其原理是在碱性环境下 蛋白质分子中的肽链结构能与 Cu2+络合生成络合物,同时将 Cu2+还原成 Cu+。BCA 试剂可敏感特异地与 Cu+结合,形成稳定的有颜色的复合物。在 562nm 处有高的光

  吸收值,颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。使用本试剂盒检测灵敏度高,对不同种类蛋白质检测变异系数小,操作简单。

  Bradford法:

  Bradford法是最简单和快速的比色蛋白定量方法。这一方法基于考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定。反应化合物在 465-595 nm 处有最大的光吸收值,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系,因此可检测 595 nm 的光吸收值的大小计算蛋白的含量。

  BCA法:

  优点:

  1.准确:变异系数远小于考马斯亮蓝染色法(bradford 法)

  2.线性范围宽,检测灵敏,检测范围:20-2000 μg/ml

  3.与金属离子、还原剂和螯合剂、去污剂兼容性好

  4.质量检测标准曲线线性关系 R2 值一般为 0.998

  缺点:

  与 Bradford 法相比不能迅速检测,需要 37℃孵育 30 min。

  Bradford法:

  优点:

  1. 与 BCA 法相比,使用本产品反应迅速,即加即检

  2. 灵敏度范围为 100-1500 μg/ml

  3. 质量检测标准曲线线性关系 R2 值一般 0.980

  缺点:

  1. 与金属离子、还原剂和螯合剂、去污剂兼容性差

  2. 精确度没有BCA法高

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