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免疫组化遇到瓶颈期肿么办?

阅读次数:1383    发布时间:2019/7/30 9:40:22

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    一、标本固定:
    固定的目的是:
    ①防止标本从玻片上脱落;
    ②除去防碍抗原-抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果;
    ③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛。

    二、脱水、石蜡包埋和制片:脱水用梯度乙醇(由低到高)充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则,容易裂片和脱片等。

    三、脱蜡和水化:这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20min,但当天制好的切片一般先60度3-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脱蜡和水化不全易产生非特异性背景着色。

    四、抗原修复:由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中,发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用,从而失去抗原性;通过抗原修复,使得细胞内抗原决定族重新暴露,提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种,高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种(具体的可以查阅相关资料,大量的:中性的、高pH的等)。

    五、细胞通透:目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内,故在细胞免疫组化时尤为推荐使用,这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

    六、灭活内源性过氧化物酶和生物素:在传统的ABC法和SP法中,免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰,必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。

    七、血清封闭:组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合,造成后续结果的假阳性;封闭血清一般是和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合;一般室温10-30min。但也要防止封闭过度。

    八、一抗和二抗浓度和孵育时间:一抗孵育条件在免疫组化反应中zui重要,包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果zui佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37度1-2h,4度过夜(从冰箱拿出后37度复温45min)。具体条件还要摸索。二抗孵育条件:二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度。

    九、抗体稀释液:其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可,但专用的抗体稀释液中除PBS成份外,还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份,对抗体的多次回收利用较好。

    十、切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗):为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要。
    注意:
    ①单独冲洗,防止交叉反应造成污染。
    ②温柔冲洗,防止切片的脱落,一般用浸洗方式;
    ③冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。
    ④PBS的PH和离子强度的使用和要求(建议PH7.4-7.6,浓度是0.01M;中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解)

    十一、DAB显色:背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的,主要由显微镜下控制显色时间,到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗。

    十二、复染:目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位,经常用苏木素复染(胞核染料)。

    十三、封片:为了长期保存,我们一般用中性树胶等封片,避免产生气泡,方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产生气泡。

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原创作者:上海恒远生物科技有限公司

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