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解决方案

实验血液样本的收集与保存学"废"了吗?

阅读次数:1668    发布时间:2020/8/26 11:05:30

    血液样本的收集与保存

    全血根据收集的条件,分成不抗凝和抗凝两种。同时,不抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血清;抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血浆。

    标本的存放温度及时间,血清、血浆及细胞分离的方法步骤也是分析前影响检验结果的重要因素。抽血后,血细胞因代谢需要,要消耗掉部分营养成分,故对这些成分进行测定时,需及时地离心以分离掉细胞成分。

    采血前个体的准备情况,如空腹时间的长短、采样时间的确定及采血时患者的姿势;止血带应用时间,输液情况,体育运动,抗凝剂及稳定剂的选用;标本的处理等均可影响到某些检验指标的水平。故标本采集过程应标准化,以大限度地减少分析前误差。

    一、不抗凝收集血清:

    1.无添加剂的干燥空管收集:

    血管内壁均匀涂有防止挂壁的药剂(硅油)。它利用血液自然凝固的原理使血液凝固,等血清自然析出后,离心使用。主要用于血清生化(肝功、肾功、心肌酶、淀粉酶等)、电解质(血清钾、钠、氯、钙、磷等)、甲状腺功能、药物检测、艾滋病检测、肿瘤标志物、血清免疫学检测。
    亦可直接用干燥EP管收集全血,充分静置使得红细胞充分自然凝固后,离心分离出血清待用或保存。

    2.用促凝管收集:

    采血管内壁均匀涂有防止挂壁的硅油,同时添加了促凝剂。促凝剂能激活纤维蛋白酶,使可溶性纤维蛋白变成不可溶性的纤维蛋白聚体,进而形成稳定的纤维蛋白凝块,如果想快点出结果时,可采用促凝管。一般静置半小时到1小时,直接离心分离出血清待用或保存,常用于急诊生化。

    3.含有分离胶及促凝剂的采血管收集:

    管壁经过硅化处理,并涂有促凝剂可加速血液的凝固,缩短检验时间。管内加有分离胶,分离胶与PET管具有很好的亲和性,确实起到隔离作用,一般即使在普通离心机上,分离胶能将血液中的液体成分(血清)和固体成分(血细胞)彻底分开并积聚在试管中形成屏障。离心后血清中不产生油滴,主要用于血清生化(肝功、肾功、心肌酶、淀粉酶等)、电解质(血清钾、钠、氯、钙、磷等)、甲状腺功能、药物检测、艾滋病检测、肿瘤标志物、血清免疫学。

    用促凝管的优点:

    ①加速红细胞的凝固,无需长时间的静置;
    ②带有分离胶,有效的将血清分离出来,更好的避免溶血;

    收集血清的缺点:
    ①需要红细胞的充分凝固,所需静置时间较长;
    ②分离出的血清相对较少,1ml全血不抗凝约只能分离出0.2-0.3ml血清。

    二、抗凝收集血浆:

    收集抗凝全血,轻轻颠倒充分抗凝后,可直接离心分离血浆待用或保存。根据不同抗凝剂的性能特征,选择合适的抗凝剂。实验室常用的抗凝剂有肝素的各种盐、EDTA及枸橼酸钠。

    1.肝素抗凝:

    常用的抗凝剂,一般情况下对相关指标都不会有干扰,同时抗凝比例较大(抗凝剂:全血=1:30),对血液基本没有稀释影响。

    肝素是一种含有硫酸基团的粘多糖,带有强大的负电荷,具有加强抗凝血酶III灭活丝氨酸蛋白酶的作用,从而阻止凝血酶的形成,并有阻止血小板聚集等多种抗凝作用。肝素管一般用于生化及血流变的检测,是电解质检测的zui佳选择,检验血标本中的钠离子时,不能使用肝素钠,以免影响检测结果。也不能用于白细胞计数和分类,因肝素会引起白细胞聚集。

    尽管用肝素的三种盐抗凝所得电解质浓度无显著差别,但肝素锂还是被认为是好的。这主要是人们认为肝素钠可使钠的测定值偏高,肝素铵可使血氨测定值偏高(尿素酶法测定)。

    肝素可抑制分子生物学中常用的一些工具酶,如限制性内切酶、Taq酶等,可影响PCR的实验结果。可采用一些方法消除肝素的抑制效应,如利用肝素酶,或在分离白细胞后用缓冲液洗涤白细胞两次以上等。然而,许多实验工作者仍不愿意在进行分子生物学实验时采用肝素作抗凝剂。

    2.EDTA抗凝:

    乙二胺四乙酸是一种氨基多羧基酸,可以有效地鳌合血液中的钙离子,鳌合钙会将钙从反应点移走将阻止和终止内源性或外源性凝血过程,从而防止血液凝固,与其他抗凝剂比较而言,其对血球的凝集及血细胞的形态影响较小,故通常使用EDTA盐(2K、3K、2Na)作为抗凝剂。用于一般血液学检查,不能用于血凝、微量元素及PCR检查。
    由于EDTA会螯合重金属离子,用该抗凝剂的话,部分带有金属离子的大分子酶都会有大量损失,具体看客户测定的指标来选择,做血常规的话必须用EDTA抗凝。

    3.枸橼酸盐抗凝:

    柠檬酸钠通过作用于血样中钙离子鳌合而起抗凝作用,国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐为3.2%或3.8%,抗凝剂与血比例为1:9,主要用于纤溶系统(凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血酶时间、纤维蛋白原)。采血时应注意采足血量,以保证检验结果的准确性,采血后应立即轻轻颠倒混匀5-8次。由于抗凝比例较小(抗凝剂:全血=1:9),对血液有一定的稀释,一般不建议。

    选择抗凝的注意点:

    ①每一份样本所加的抗凝剂的量要一致,同时所取的全血的量也要尽量一致;
    ②收集抗凝全血后一定要轻轻颠倒,充分抗凝,防止部分血液未接触到抗凝剂而导致凝固;
    ③抗凝全血收集的血浆相对较多(1ml抗凝全血能分离出0.4-0.5ml血浆);
    ④抗凝收集的血浆冷冻保存后,解冻时可能会出现絮状浑浊,如有则需要离心去掉浑浊后用于测定。

    血清、血浆收集好后,暂时不测定,可立即低温冻存,温度越低越好,中间如不反复冻融,-20℃以下可保存一个月,-70℃以下可保存三个月。

    三、收集血清、血浆所用离心转速:

   分离血清或血浆,根据种属不同,离心转速也有差异,推荐离心转速为:

    ①小鼠:一般1000-1500转/分,离心8-10分钟;
    ②大鼠、兔子:一般2000-2500转/分,离心8-10分钟;
    ③人:一般2500-3000转/分,离心8-10分钟。

    四、高脂及溶血因素的影响:

    溶血的影响:

    溶血对某些检验指标的的影响不仅取决于所采用的方法,也取决于所用的分析仪器。采用双长测定法可在一定程度上消除Hb的颜色干扰,然而Hb的干扰并不能完全消除,尤其是当Hb可以与采用的试剂发生作用时。总的来说,轻微的溶血,对大多数临床化学指标的测定方法无明显干扰。严重的溶血,可能有两方面的影响:(1)测定成分在红细胞内的浓度高于血浆时,导致测定结果偏高;(2)测定成分在RBC内浓度低于血浆时,产生轻微的稀释效应。

    用肉眼观察标本是否溶血只能是粗略的判断。只有当血清中血红蛋白浓度超过20mg/dl时,肉眼才能见到溶血情况。有人报导0.1%的红细胞发生溶血后,其血清外观与非溶血标本一致;1%红细胞发生溶血后,血清清亮,呈樱红色,这样的标本就代表了中度溶血。有人建议用血清Hb浓度来对溶血程度进行判断。非溶血标本血清游离Hb为4.8±3.2mg/dl,中度溶血血清Hb为43.5±13.9mg/dl。即使轻微的溶血也可能导致相应指标的测定结果偏高(如LDH、ACP、K等),这样的标本应尽量避免使用。

    高脂的影响:

    高脂血症所产生的混浊对某些指标测定的影响,同样取决于所采用的测定方法。一般而言,脂血通过样品不均一性、水置换、亲脂成分的吸收而影响检验结果的准确性。肉眼可见的脂血标本可影响总蛋白的测定、电泳及色谱分析等。

    五、全血或红细胞的收集及保存:

    测定全血或者是红细胞中相关指标的话,首先需要收集抗凝全血。

    全血:收集抗凝全血,轻轻颠倒充分抗凝后,可直接定量吸取全血,用冷蒸馏水制备溶血液后用于不同指标的检测;也可定量吸取全血,转入EP管,低温冻存(温度越低越好),测定之前解冻并按比例加入冷蒸馏水制成溶血液用于检测。

    红细胞:收集抗凝全血,轻轻颠倒充分抗凝后,直接离心吸走血浆,留下层红细胞,加入3倍体积的生理盐水,轻轻颠倒混匀,500~1000转/分,离心5分钟,弃上清留沉淀红细胞,重复2~3次,至上清液无色为止(洗涤红细胞)。

    ①直接定量吸取红细胞,按比例加入冷蒸馏水制成溶血液待测;

    ②定量吸取红细胞,转入EP管,立即低温冻存(温度越低越好),测定之前解冻,并按比例加入冷蒸馏水制成溶血液用于检测(解冻后部分红细胞会破裂,因此样本冷冻保存之前必须进行定量)。

    溶血液的制备:定量吸取红细胞或者全血,按比例加入冷蒸馏水,充分漩涡混匀制备溶血液(对光观察,溶液澄清透亮,可显微镜观察红细胞是否破裂,如未破可延长混匀时间),稀释成不同浓度用于不同指标的检测。

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