技术服务专区
酶联免疫(ELISA)代测服务
ELISA(酶联接免疫吸附反应分析)是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的..
组织形态学实验技术服务
组织包埋,切片,免疫组化,免疫荧光,偏振光,原位杂交,凋亡,常规染色,特殊染色,组织形态图..
Western Blot实验技术服务
Western Blot是利用抗原抗体的免疫反应,先将蛋白通过SDS-PAGE凝胶电泳分离开,再利用电场力的作..
解决方案

WB实验,这些问题您是否也遇到过?

阅读次数:3087    发布时间:2020/9/21 11:46:18

    蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。WB实验作为科研研究中实验其中一种方法,却蕴含了很多知识,可谓是小实验里却有大文章。针对WB实验经常遇到的一些问题,恒远生物技术专员总结出了应对的一系列“5点”注意事前及建议,希望能帮助到您!

实验的5点注意事项:
1.阳性对照对裂解物用来表明实验室有效并且是正确的,及可证明目标蛋白不在样本表达。
2.跑在样品旁边的分子量标准能测定蛋白分子量的大小并且能监测电泳的进展。
3.避免手指直接接触膜,应使用镊子,手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑。
4.确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同,边缘太大会导致在进行转膜时电流不能通过膜。
5.过度曝光的胶片不适合用于分析,因为不能判定相对蛋白量。

解决无信号的5点建议:

1.二抗需和一抗宿主的物种相同(如一抗来自兔,二抗为抗兔抗体)。原因: 一抗和二抗不匹配。
2.参照说明书,设置阳性对照。原因:一抗不识别检测物种蛋白。
3.每泳道蛋白上样量不低于20~30μg,设置阳性对照。原因:抗原量不足。
4.使用可逆染色剂如丽春红S检测转膜效果,检测转膜操作是否正确。PVDF膜预先浸在甲醇中。原因:转膜不充分。
5. 使用含0.5%脱脂奶粉或更换封闭剂,减少封闭时间。原因:过度封闭使目标蛋白不能显色。

解决抗体问题的5点建议:
1. 一抗,二抗的比例比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。 
2. 做细胞信号传导,要做磷酸化某因子Western Blot,对二抗无要求,要看您实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。
3.不同抗体,即使是同一公司的抗体,其最佳的抗体稀释度也是不一样的,需要您实验摸索。
4. 如果您所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。(限于单抗) 
5.抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融。

解决背景高的5点建议:
1.稀释抗体至合适浓度,以更高稀释度抗体孵育更长时间。
2.抗体孵育温度过高: 4℃孵育。
3.膜干燥:保证充分的反应液,避免出现干膜现象。
4.封闭不充分: 延长封闭时间, 考虑更换合适的封闭剂(脱脂奶粉,BSA,血清等)。
5.未结合蛋白洗涤不充分: 增加洗涤次数。

解决多条带现象的5点建议:
1.查阅文献。原因:体内表达的蛋白具有多种修饰形式,如乙酰化,甲基化,糖基化等。
2.在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。原因:蛋白样本降解(蛋白质分子量降低)。
3.降低抗体浓度或者抗体孵育时间。原因:一抗浓度过高,高浓度时常出现多蛋白条带。
4.使用原始未传代的细胞株,和现在的细胞株一起做平行对照试验。原因: 细胞传代次数过多,使其蛋白表达不同。
5.降低抗体浓度,增加二抗对照(不加一抗)。原因:二抗浓度过高,高浓度产生非特异结合

解决其他问题的5点建议:
1.转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均。
2.背景有黑色斑点:抗体结合了封闭剂(过滤封闭剂)。
3.“微笑”条带:迁移过快或电泳温度过高,改变了pH值和迁移速度(降低迁移速度或低温电泳)。
4.抗体量不足:确保在孵育时抗体充分浸没膜。
5.目的条带染色过低/过高:分离不彻底。
    
       今天的内容就分享到这里,如果您在做elisa试剂盒实验中遇到不明白的问题,不妨来电详询本公司业务员,我们将为您安排技术专员进行解答。另外:本公司为了喜迎开学,特展开了一系列优惠活动,具体活动内容详情,可直接电询!

原创作者:上海恒远生物科技有限公司

品质保证

防伪易碎商标贴,四招助您分辨真假。

送货保障

产品均有现货,多家快递公司合作准时到达。

售后服务

产品及实验问题,提供技术支持保障。

  • 电话:18221656311
  • 手机:18221656311
  • 联系人:钱经理

上海恒远免疫学第三方检测中心

微信扫描二维码,参与上海恒远活动,

劲爆优惠触手可得!

主营产品:

酶联免疫试剂盒,酶联免疫实验代测,elisa试剂盒,原装elisa试剂盒,elisa检测试剂盒,进口血清

公司名称:上海恒远生物科技有限公司 公司地址:上海市松江临港科技城汉桥文化科技园B座 邮政编码:201615 邮箱:2885617636@qq.com

联系人:钱经理 联系电话:18221656311 ICP备案号: 沪ICP备11004148号-22 技术支持:阿仪网

娇娇

小李

小强

小李

小钱