先把蛋白稀释一定的倍数，比如说10倍、20倍稀释（这样可以大体确定一个参数），将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定o.d值，选择o.d值≥1.0的那个抗原稀释度为zui适包被浓度。一般总是要选择那个o.d值稍大于1.0，而不选择小于1.0的抗原浓度。阴性参考血清o.d值要求<0.1-0.2。也就是要求阳性参考血清和阴性参考血清的o.d值有明显差别。
在ELISA试剂盒实验血清为什么要稀释？有两个原因：
1.竞争抑制比较明显，应稀释竞争物；
2.血清中含有的性腺激素比较低，应该浓缩才对。
ELISA试剂盒血清标本的保存建议有以下几点：
1.样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。
2.血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，ELISA如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。
3.冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。
4.要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。
5.标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。
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