阅读次数:3336 发布时间:2019/12/17 10:06:39
可能原因 | 解决办法 |
封闭不充分或封闭液不合适 | 选择合适封闭液,并优化封闭条件时间与温度 |
抗体孵育浓度过高,孵育时间过长或温度过高 | 优化抗体孵育浓度与时间 |
洗涤不充分 | 洗涤次数和时间适当延长 |
二抗非特异性结合 | 设置二抗对照,并选择合适的二抗试剂 |
干膜 | 操作过程中保持膜湿润状态 |
膜污染 | 操作过程保持膜整洁,不要用手按压膜的任何部位 |
发光底物过度残留 | 吸干多余发光液后进行显影 |
显影时间过长 | 压胶片时间长短适宜,在显影液中不要停留太长时间 |
可能原因 | 解决办法 |
样本中所含目的蛋白表达量过低或无表达 | 确认样本可行性,对表达过低的样本进行富集后再进行实验;更换超敏ECL并适当延长曝光时间 |
蛋白提取时降解 | 蛋白提取时,保持低温状态,并加入相应的蛋白酶抑制剂 |
蛋白样本保存条件不合适,蛋白降解 | 蛋白样本建议加入。上样缓冲液煮沸变性后保存,对于稀有样本建议分装于-80°C保存;避免反复冻存,尽快完成检测 |
蛋白转膜效率低 | 丽春红染色确认转膜体系是否正常 |
抗体孵育浓度过低或时间过短 | 优化抗体孵育量,一抗建议4℃ 过夜孵育 |
一抗二抗检测体系不匹配 | 选择合适的一抗二抗 |
抗体失活 | 正确保存抗体 |
显影液使用时间过长 | 使用新鲜试剂,并避光保存 |
可能原因 | 解决办法 |
Marker指示大小偏差 | 选择合适的预染Marker,并与非预染 Marker对比,观察差异大小 |
电泳体系影响 | 避免边缘孔的不稳定因素,在中间孔上样,边缘孔加入等量上样缓冲液平衡体系 |
翻译后修饰 | 查阅文献,确认蛋白本身是否存在磷酸化或糖基化等修饰 |
翻译后剪切及异构体 | 查阅文献,确认蛋白是否存在多种剪切活性形式 |
蛋白多聚体形成 | 蛋白二聚体或多聚体形成,在样本制备过程中,使用新鲜的DTT或β-巯基乙醇,保持蛋白单体状态 |
蛋白相对电荷变化 | 蛋白氨基酸组成不同,某些蛋白所盖,导致蛋白迁移率与蛋白大小不盖,导致蛋白迁移率与蛋白大小不成正比 |
可能原因 | 解决办法 |
反影或膜上可见黄色条带 | 一抗二抗抗体浓度过高或样本上样量过大,导致酶被瞬间消耗 |
白色空点 | 转膜三明治制备时有气泡,或者抗体孵育不均匀,应在摇床上孵育 |
黑色斑点背景 | 封闭液颗粒残留,在使用前应充分搅拌溶解 |
微笑条带 | 条带迁移过快,降低电压; 胶凝固不均匀,正确制备凝胶 |
皱眉条带 | 电泳时,电泳丝底物聚集大量气泡,导致电压不均衡 |
条带拖尾 | 样品内有不溶物,离心或者优化样本蛋白提取;上样量过载,降低上样量;使用凝胶浓度不合适,蛋白分辨率较低,调整交联剂比例;电泳液反复使用多次,重新配置新鲜电泳液 |
条带扭曲 | 胶界面不平导致歪斜或凝胶制备不均匀;样本中盐离子浓度过高,干扰电泳;电压过高,电泳迁移过快 |
条带粘连,无孔间间隙 | 胶没凝好,蛋白上样量过大 |
原创作者:上海恒远生物科技有限公司
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