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WB实验,这些问题您是否也遇到过?

阅读次数:1875    发布时间:2020/9/21 11:46:18

    蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。WB实验作为科研研究中实验其中一种方法,却蕴含了很多知识,可谓是小实验里却有大文章。针对WB实验经常遇到的一些问题,恒远生物技术专员总结出了应对的一系列“5点”注意事前及建议,希望能帮助到您!

实验的5点注意事项:
1.阳性对照对裂解物用来表明实验室有效并且是正确的,及可证明目标蛋白不在样本表达。
2.跑在样品旁边的分子量标准能测定蛋白分子量的大小并且能监测电泳的进展。
3.避免手指直接接触膜,应使用镊子,手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑。
4.确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同,边缘太大会导致在进行转膜时电流不能通过膜。
5.过度曝光的胶片不适合用于分析,因为不能判定相对蛋白量。

解决无信号的5点建议:

1.二抗需和一抗宿主的物种相同(如一抗来自兔,二抗为抗兔抗体)。原因: 一抗和二抗不匹配。
2.参照说明书,设置阳性对照。原因:一抗不识别检测物种蛋白。
3.每泳道蛋白上样量不低于20~30μg,设置阳性对照。原因:抗原量不足。
4.使用可逆染色剂如丽春红S检测转膜效果,检测转膜操作是否正确。PVDF膜预先浸在甲醇中。原因:转膜不充分。
5. 使用含0.5%脱脂奶粉或更换封闭剂,减少封闭时间。原因:过度封闭使目标蛋白不能显色。

解决抗体问题的5点建议:
1. 一抗,二抗的比例比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。 
2. 做细胞信号传导,要做磷酸化某因子Western Blot,对二抗无要求,要看您实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。
3.不同抗体,即使是同一公司的抗体,其最佳的抗体稀释度也是不一样的,需要您实验摸索。
4. 如果您所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。(限于单抗) 
5.抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融。

解决背景高的5点建议:
1.稀释抗体至合适浓度,以更高稀释度抗体孵育更长时间。
2.抗体孵育温度过高: 4℃孵育。
3.膜干燥:保证充分的反应液,避免出现干膜现象。
4.封闭不充分: 延长封闭时间, 考虑更换合适的封闭剂(脱脂奶粉,BSA,血清等)。
5.未结合蛋白洗涤不充分: 增加洗涤次数。

解决多条带现象的5点建议:
1.查阅文献。原因:体内表达的蛋白具有多种修饰形式,如乙酰化,甲基化,糖基化等。
2.在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。原因:蛋白样本降解(蛋白质分子量降低)。
3.降低抗体浓度或者抗体孵育时间。原因:一抗浓度过高,高浓度时常出现多蛋白条带。
4.使用原始未传代的细胞株,和现在的细胞株一起做平行对照试验。原因: 细胞传代次数过多,使其蛋白表达不同。
5.降低抗体浓度,增加二抗对照(不加一抗)。原因:二抗浓度过高,高浓度产生非特异结合

解决其他问题的5点建议:
1.转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均。
2.背景有黑色斑点:抗体结合了封闭剂(过滤封闭剂)。
3.“微笑”条带:迁移过快或电泳温度过高,改变了pH值和迁移速度(降低迁移速度或低温电泳)。
4.抗体量不足:确保在孵育时抗体充分浸没膜。
5.目的条带染色过低/过高:分离不彻底。
    
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